發(fā)布時(shí)間:2020-08-19 09:28 點(diǎn)擊:次
消毒和滅菌是微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最基本的操作技術(shù),因此從事藥品生產(chǎn)、檢驗(yàn)的人員均應(yīng)了解消毒和滅菌的基本概念、兩者的關(guān)系,各自的應(yīng)用方法及其意義,操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)的操作規(guī)程,一方面確保生產(chǎn)與檢驗(yàn)工作的效果,另一方面也是對(duì)自身安全的保護(hù)。
消毒和滅菌的概念:
1、消毒:指對(duì)病原微生物的繁殖體的致死作用,但不能殺死芽孢等全部微生物,因此消毒是不徹底的,不能代替滅菌。凡用于消毒的化學(xué)藥品稱為消毒劑,因此人們也常稱消毒劑為化學(xué)消毒劑。
2、滅菌:殺滅物體中所有活的微生物(含芽孢)的作用,滅菌是采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施。通常用物理方法來達(dá)到滅菌的目的。
二、消毒和滅菌的關(guān)系
1、共性:殺滅微生物以控制其污染和防止傳播。
2、區(qū)別:
消毒滅菌方法
目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法(如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等)和化學(xué)方法(消毒劑、抗生素)兩大類。
干熱滅菌法是利用恒溫干燥箱內(nèi)120ºC~150ºC的高熱,并保持90~120分鐘,殺死細(xì)菌和芽孢,達(dá)到滅菌目的的一種方法。
主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅菌,且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。
用此方法滅菌的物品干燥,易于貯存。
酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌的方法之一。在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)工作時(shí),常須利用工作臺(tái)面上的酒精燈火焰對(duì)金屬器具及玻璃器皿口緣進(jìn)行補(bǔ)充滅菌。
壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前最常用的一種滅菌方法。
它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力,使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。
適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和某些培養(yǎng)液的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調(diào)整為1.0~1.1kg/cm2,維持20~30min即可達(dá)到滅菌效果。
利用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌的方法。
紫外線是一種低能量的電磁輻射,可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機(jī)制是通過對(duì)微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活。
適合于實(shí)驗(yàn)室空氣、地面、操作臺(tái)面滅菌。滅菌時(shí)間為30min。用紫外線殺菌時(shí)應(yīng)注意,不能邊照射邊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,因?yàn)樽贤饩€不僅對(duì)人體皮膚有傷害,而且對(duì)培養(yǎng)物及一些試劑等也會(huì)產(chǎn)生不良影響。
過濾除菌法是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾,使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留,從而達(dá)到除菌的方法。
過濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養(yǎng)液等。
目前,常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾除菌,或用玻璃細(xì)菌濾器、濾球負(fù)壓過濾除菌。濾膜孔徑應(yīng)在0.22~0.45μm范圍內(nèi)或用更小的細(xì)菌濾膜,溶液通過濾膜后,細(xì)菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻,并利用濾膜的吸附作用,阻制小于濾膜孔徑的細(xì)菌透過。
化學(xué)消毒劑消毒法用于那些不能利用物理方法進(jìn)行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、某些實(shí)驗(yàn)器皿等。
1)消毒劑分類
依殺滅微生物能力進(jìn)行分類,有以下三種:
2)消毒劑的選擇
消毒劑的種類很多,性質(zhì)不一,因此應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求選擇既安全又有效的消毒劑。在選擇時(shí)至少應(yīng)考慮以下幾點(diǎn):
3)消毒劑的使用
A、影響消毒效果的因素
影響消毒劑效能的因素比較復(fù)雜,一般都因消毒劑的種類而異,因此各種消毒劑使用時(shí)應(yīng)注意以下因素
a)微生物種類及數(shù)量
消毒劑的有效濃度及作用時(shí)間因微生物的種類及數(shù)量的不同而有差異,不同類型的病原微生物對(duì)消毒劑的抗力不同。對(duì)于細(xì)菌繁殖體來說,革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)消毒劑的耐受性強(qiáng),尤其是銅綠假單胞菌的耐受性較強(qiáng);芽孢的耐受力最強(qiáng),在化學(xué)消毒劑中,戊二醛和過氧乙酸可殺滅芽孢,但其作用力不如熱力滅菌方法;病毒對(duì)消毒因子的耐力也因其種類的不同而有相當(dāng)大的差異,親水病毒的耐力較親脂病毒要強(qiáng);真菌對(duì)大多數(shù)化學(xué)藥物的耐受力較強(qiáng),因此適用于細(xì)菌的消毒劑并不一定適用于真菌,但真菌一般耐熱性較差。微生物污染數(shù)量多時(shí),應(yīng)加長(zhǎng)消毒接觸時(shí)間、加大消毒劑用量或提高消毒劑濃度。
b)溫度
一般來說,消毒的速度隨溫度的提高而加快,其殺菌作用也相應(yīng)增強(qiáng)。溫度影響的原理是其可影響菌體表面和酶系統(tǒng)的活性,以及消毒劑的分子運(yùn)動(dòng),使得消毒劑與菌細(xì)胞接觸的機(jī)會(huì)增加,從而使消毒的時(shí)間縮短。但溫度的變化對(duì)各種消毒劑的影響不同,如醇類和酚類一般受溫度影響較小,但如甲醛、環(huán)氧乙烷等溫度升高一倍時(shí),其殺菌效果可增加十倍。
c)濃度
消毒劑的濃度應(yīng)考慮的是其主要成分的濃度,根據(jù)不同類型的消毒劑性質(zhì),提高或降低濃度,均可顯著影響消毒效果。一般降低消毒劑的濃度需延長(zhǎng)相應(yīng)的消毒時(shí)間,且消毒劑內(nèi)的有效成分在其保存期內(nèi)也會(huì)相應(yīng)下降。
d)pH值
酸堿度常影響酸性或堿性消毒劑的電離度,改變其溶解度及分子結(jié)構(gòu),影響不同離子型消毒劑的作用,在堿性環(huán)境中,細(xì)菌表面負(fù)電荷增多,陽(yáng)離子型消毒劑作用較強(qiáng),在酸性環(huán)境中,細(xì)菌表面負(fù)電荷減少,陰離子型消毒劑的殺菌效果較好;另外pH的過高或過低對(duì)微生物的生長(zhǎng)及表面物理化學(xué)狀態(tài)均有影響。
e)有機(jī)物質(zhì)
消毒環(huán)境中存在有機(jī)物,則其可在微生物表面形成保護(hù)層阻礙消毒劑與微生物的接觸或延遲消毒劑的作用,可能導(dǎo)致微生物逐漸產(chǎn)生對(duì)藥物的適應(yīng)性,這些情況均會(huì)不同程度的降低消毒劑的消毒作用,如有機(jī)物可中和一部分消毒劑,有機(jī)物和消毒劑作用,形成溶解度比原來更低或殺菌作用比原來更弱的化合物。一般來說消毒劑中的重金屬類及表面活化劑等受有機(jī)物的影響較大。
B、其他注意點(diǎn)
a)微生物對(duì)消毒劑的耐受性
一般來說,為了避免微生物對(duì)消毒劑的耐受性,很多企業(yè)的消毒劑是輪換使用的,現(xiàn)今在學(xué)術(shù)界對(duì)于消毒劑的輪換使用的必要性尚存爭(zhēng)議,但FDA的監(jiān)管引文中主導(dǎo)應(yīng)進(jìn)行消毒劑輪換,但消毒劑的輪換使用周期應(yīng)以歷史環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)制訂。微生物對(duì)消毒劑的耐受性較抗生素要低一些,因?yàn)橄緞┍瓤股赜懈鼜?qiáng)的殺菌作用。另外使用高濃度的消毒劑來殺滅少量的微生物通常影響不大,因此應(yīng)考慮選擇合適的消毒劑來對(duì)抗不斷增強(qiáng)的耐受性。同時(shí)建議定期進(jìn)行試驗(yàn)證明或評(píng)估從環(huán)境菌監(jiān)測(cè)中分離出的微生物(含已知及新的類型)對(duì)該環(huán)境使用消毒劑的敏感性。
b)規(guī)范及安全使用
在消毒劑的使用過程中,人員培訓(xùn)及是否規(guī)范及安全使用該消毒劑對(duì)其應(yīng)用有很大影響。接觸消毒劑的人員要求進(jìn)行微生物、清潔滅菌操作、消毒劑的制備/使用/安全處理廢棄稀釋及濃縮消毒劑的培訓(xùn)。如正確配制消毒劑是關(guān)鍵,很多消毒效果不佳或失敗的例子源于消毒劑的過度稀釋,另外用于無(wú)菌操作流程的消毒劑必須用無(wú)菌水稀釋,一般稀釋用水推薦純化水及更高級(jí)別的水,因?yàn)樗挠捕葧?huì)影響一些消毒劑的功效。另外在處理可能產(chǎn)生有毒刺激性氣體、腐蝕性較強(qiáng)及濃度較大的消毒劑(如殺孢子劑)時(shí),應(yīng)配備適宜的安全防護(hù)裝備,如安全眼鏡、面罩、過濾氣味的口罩、手套、防護(hù)服等。在消毒劑的使用同時(shí)應(yīng)考慮清潔劑的配合使用,清潔是去除表面顆粒及微生物、去除殘留并提高后續(xù)消毒效果,因此清潔是為后續(xù)的消毒做好準(zhǔn)備,同時(shí)規(guī)避前后2種輪換消毒劑的互相作用。
抗生素抑菌法主要用于培養(yǎng)液,是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。
不同種類物品及培養(yǎng)物
消毒滅菌方法
培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)、觀察或更換培養(yǎng)液時(shí),必須從各方面防止任何污染物進(jìn)入培養(yǎng)液或容器,所以無(wú)菌操作室的滅菌是至關(guān)重要的。
由于無(wú)菌操作室的污染來源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子,因此長(zhǎng)期停用后的無(wú)菌操作室應(yīng)進(jìn)行熏蒸滅菌。
熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[(2ml甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]進(jìn)行無(wú)菌室的滅菌。經(jīng)常使用的無(wú)菌操作室,在每次使用前都應(yīng)進(jìn)行地面衛(wèi)生清潔,并用紫外線燈照射30 min,進(jìn)行空氣滅菌。對(duì)超凈工作臺(tái),每次操作前用紫外燈照射30min,然后用70%~75%酒精擦拭。
培養(yǎng)液在制備過程中帶有各種雜菌,分裝后應(yīng)立即滅菌,或在24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。目前常用過濾除菌法除去培養(yǎng)物操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌。或?qū)ε囵B(yǎng)液中耐熱組分先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌,然后在無(wú)菌室加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液,混勻后分裝備用。
使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí),將分裝好的培養(yǎng)液放入底部有一定量(淹沒加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內(nèi),增壓至0.35~0.4kg/cm2時(shí)排凈滅菌器內(nèi)冷空氣,以便使蒸汽能到達(dá)各個(gè)消毒部位,保證消毒滅菌徹底。然后繼續(xù)加壓加熱,當(dāng)壓力表讀數(shù)達(dá)到1.0~1.1kg/cm2為121ºC,保持15~20 min即可。由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力,所以在一定壓力下保持較長(zhǎng)的消毒滅菌時(shí)間是必須的。
在121ºC的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及高度耐熱的芽孢桿菌,因此許多培養(yǎng)液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.0~1.1 kg/cm2、121ºC。消毒滅菌時(shí)間與需要消毒滅菌的培養(yǎng)液量密切相關(guān)(表2-3),時(shí)間不足達(dá)不到滅菌效果,時(shí)間過長(zhǎng)培養(yǎng)液內(nèi)的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞,影響培養(yǎng)液成分。消毒滅菌結(jié)束后,關(guān)閉熱源,只有當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力降為零時(shí)才能打開放氣閥,排除剩余蒸汽,取出培養(yǎng)液。不可在壓力較高時(shí)打開放氣閥,引起減壓沸騰,使容器中液體溢出。
培養(yǎng)液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì),則需用過濾方法消毒滅菌。
首先對(duì)培養(yǎng)液中耐熱組分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后放置在無(wú)菌場(chǎng)所,固體培養(yǎng)液在40ºC左右瓊脂即將凝結(jié)前,加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液,混勻后冷卻備用。液體培養(yǎng)液在冷卻到室溫后再加入過濾除菌溶液。過濾除菌時(shí),使用孔徑為0.22~0.45μm或更小的細(xì)菌濾膜。過濾除菌可利用抽濾裝置或注射過濾器進(jìn)行,所用器皿均應(yīng)進(jìn)行高壓消毒滅菌,溫度不應(yīng)超過121ºC。
玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌
玻璃器皿可進(jìn)行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌,但在蒸汽滅菌后最好及時(shí)烘干水分。
對(duì)不能進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡,使用前在無(wú)菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí),用紫外線重復(fù)殺菌。
實(shí)驗(yàn)室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋對(duì)塑料器皿進(jìn)行消毒,消毒后的器皿要充分散氣2~4小時(shí)后才可使用。
無(wú)菌操作所用的各種器械,一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌,或用75%酒精浸泡,然后在無(wú)菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí)再用紫外線重復(fù)殺菌;在使用期間可多次對(duì)其進(jìn)行酒精燈火焰灼燒滅菌。
培養(yǎng)材料的消毒滅菌
采自動(dòng)物機(jī)體的實(shí)驗(yàn)材料,攜帶著微生物及雜質(zhì),接種前須進(jìn)行表面消毒滅菌,對(duì)內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以淘汰。
從動(dòng)物機(jī)體采集的某些組織塊,須用消毒劑進(jìn)行浸泡處理,進(jìn)行表面消毒。常用消毒劑有過氧化氫(10~12%,浸泡5~15min)、過氧乙酸(0.05%,浸泡30 s~1min)、酒精(70~75%,浸泡2min)。
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