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山陽藥業(yè)健康小知識

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食品微生物菌落總數(shù)、大腸菌群等標(biāo)準(zhǔn)解讀

GB 4789.2-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定 01 稀釋度的選擇 液體樣品可直接取原液進行檢驗;固體或者半固體則必須依據(jù)檢驗經(jīng)驗,選取2-3個適宜稀釋度進行檢驗(

GB 4789.2-2016

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定

 

01
稀釋度的選擇

 

液體樣品可直接取原液進行檢驗;固體或者半固體則必須依據(jù)檢驗經(jīng)驗,選取2-3個適宜稀釋度進行檢驗(一般樣品選取1:10,1:100,1:1000三個稀釋度進行檢驗。若遇到不常做的樣品,可適當(dāng)延長稀釋度至1:10000甚至更大)。

 

02
空白實驗

 

分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對照,若空白有菌落生長則該實驗無效。

 

03
培養(yǎng)基的傾注

 

根據(jù)對樣品污染情況的估計,若樣品有表面蔓延生長的可能性,則待第一次傾注的瓊脂凝固后,可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計數(shù)。

 

04
菌落總數(shù)的計算

 

本標(biāo)準(zhǔn)的難點在于菌落計數(shù)及計算。

 

1)菌落計數(shù)時,從低稀釋度的平板開始計數(shù)。若所有平板上的菌落數(shù)均小于30CFU,則需計數(shù)所有平板上的菌落數(shù),但僅采用最接近30CFU的兩個平板的菌落數(shù)來計算最終菌落數(shù)。

 

以固體樣品為例,菌落數(shù)選取、計算過程及結(jié)果修約如下:

 

 

2)當(dāng)?shù)谝幌♂屘荻纫粋€板上菌落數(shù)高于30,另一個低于30,則依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)以介于30-300之間的菌落數(shù)作為該稀釋梯度的菌落數(shù)。

 

以固體樣品為例,菌落數(shù)選取、計算過程及結(jié)果修約如下:
 
 

 

3)若所有平板上的菌落數(shù)均大于30CFU,則只計數(shù)30-300CFU之間的平板上的菌落數(shù),并采用這些數(shù)據(jù),依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給出的公式,進行最終菌落總數(shù)的計算,此時將大于300CFU的記為“多不可計”,以TNTC表示。

 

以固體樣品為例,菌落數(shù)選取、計算過程及結(jié)果修約如下:

 

 

4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)都大于300,則不能所有都記為TNTC,必須將最高稀釋度的兩個平板上的菌落數(shù)逐一的計數(shù),再計算平均數(shù),該平均數(shù)為該梯度的菌落總數(shù),其余平板上的菌落數(shù)可記為TNTC。

 

以固體樣品為例,菌落數(shù)選取、計算過程及結(jié)果修約如下:

 


 

5)若所有平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)。

 

 

注意:最低稀釋度的選擇對結(jié)果存在較大的影響。如:某樣品經(jīng)多次檢驗后發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)較高,檢驗人員在梯度稀釋后取1:1000,1:10000,1:100000三個梯度的稀釋液傾注平板,最終所有平板上均無菌落生長,則計算結(jié)果為<1000CFU/mL。若選取1:10,1:100,1:1000三個梯度的稀釋液傾注平板,均無菌生長,則最終結(jié)果為<10CFU/mL。

 

6)最低稀釋度兩個平板只有一個平板上長了1個菌落,若為固體樣品且本次檢驗的最低稀釋倍數(shù)為1:10,此時計算過稱為(1+0)/2×10=5,由于默認(rèn)固體樣品的最小檢出量為10CFU,固本次檢驗的菌落總數(shù)結(jié)果為10CFU。

 

注意:對于該情況,一直存在爭議,不同的檢驗人員可能做法不一,有人保留為5CFU,有人保留為10CFU,并無固定做法,建議實驗室保持一貫做法,不要隨意更改。

 

 

GB 4789.15-2016

 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)
 

 

 

1)孟加拉紅培養(yǎng)基滅菌條件比較特殊:121℃,20min;


 

2)稀釋液可選擇生理鹽水、硝酸鹽緩沖液,還可以選擇無菌水;

 

3)正置平板培養(yǎng)。未避免孢子擴散、菌落蔓延,可選擇使用一次性塑料培養(yǎng)皿;

 

4)“觀察并記錄培養(yǎng)至第5d的結(jié)果”,意味著需要從培養(yǎng)的第二天開始逐日觀察并記錄霉菌和(或)酵母的生長情況,且原始記錄須體現(xiàn)“逐日觀察”;

 

5)特別注意:"菌落數(shù)在10以內(nèi)時,采用一位有效數(shù)字報告,菌落數(shù)在10-100之間時,采用兩位有效數(shù)字報告",即:在直接吸取原液檢驗時,若兩個平板上的平均菌落數(shù)小于10,則四舍五入后的數(shù)值直接記為最終結(jié)果(不可四舍五入為10),若1:10的兩個平板上一個長1個菌落,另一個無菌落生長,則平均數(shù)為0.5,最終計算結(jié)果為5,而不是10。

 

為防止孢子蔓延污染霉菌培養(yǎng)箱,可每周用75%酒精擦拭消毒兩次或每次檢出霉菌時用殺孢子劑消毒。

 

 

 

GB 4789.3-2016  

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)
 

 

 

 

 

第二法 平板計數(shù)法

 

 

常見問題匯總

 

 

01
 
VRBA培養(yǎng)相關(guān)問題

 

1)所用器皿是否需要滅菌?

 

不需要。配制培養(yǎng)基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌。但必須清洗干凈,表面無污漬、無殘留。煮沸完成后,取下錐形瓶,用一般常用的軟紙覆蓋瓶口,并橡皮筋纏繞,待冷卻至適宜溫度后,即可傾注培養(yǎng)基。在傾注培養(yǎng)基時,須點燃酒精燈,稍微灼燒錐形瓶口。

 

2)如何保持“煮沸2min”?

 

可以用電磁爐或者電熱板進行加熱煮沸,在該培養(yǎng)基即將煮沸時調(diào)低溫度。實際操作時,不需要嚴(yán)格按照此要求進行,加熱煮沸數(shù)秒即可。因為本培養(yǎng)基很難保持煮沸2min,一旦煮沸,則培養(yǎng)基很快上涌、翻騰,若不調(diào)低問題或及時采取其它措施,則培養(yǎng)基很有可能在數(shù)秒內(nèi)噴涌出來,嚴(yán)重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1-2米范圍內(nèi)都是培養(yǎng)基飛濺的范圍。

 

3)若培養(yǎng)基未用完,是否可以冷藏起來下次用?

 

不可以。4789.28中已規(guī)定,固體培養(yǎng)基最多允許熔融一次,并且特指經(jīng)過高壓霉菌冷卻后的培養(yǎng)基還可以熔融一次后使用。且VRBA培養(yǎng)基冷卻后,再次熔融后非常容易噴涌,若溫度控制不當(dāng),底部培養(yǎng)基熔融后很快就會發(fā)生噴涌,即培養(yǎng)基未完全熔融就會發(fā)生噴涌現(xiàn)象。

 

4)傾注完成后是否需要“覆蓋一層"?如何覆蓋?

 

一般情況下不需要覆蓋。在實際操作過程中,若檢驗員初次接觸該樣品類別,則因為不確定是否會發(fā)生菌落蔓延,所以有必要在傾注培養(yǎng)基的時候再覆蓋一層,但如此反復(fù)多次測試后,若樣品中不存在菌落蔓延情況,則以后的檢驗中都不需要進行覆蓋。若重復(fù)多次測試后都有蔓延情況,則以后的檢驗中都需要覆蓋,應(yīng)該在原培養(yǎng)基已凝固或半凝固時再傾注一層培養(yǎng)基。

 

02
 
如何確定培養(yǎng)基上長得是不是大腸菌群?

 

建議新手們認(rèn)真按照標(biāo)準(zhǔn)進行證實實驗,此證實實驗操作簡單,每一次VRBA上有菌落生長都進行證實實驗,如此往復(fù)3-4次,對于哪種形態(tài)才是大腸菌群均可了然于心。

 

03
 
兩個梯度都漲了菌,如何選???

 

選取15-150CFU之間的平板,挑選可疑菌落進行證實實驗。舉例如下:

 

若兩個連續(xù)梯度的4個平板上都要挑取菌落進行證實實驗,實際操作時,可靈活操作,如1:10的兩個平板上的菌落數(shù)分別為120、123,1:100的兩個平板的菌落數(shù)分別為16,18,嚴(yán)格來講必須至少在每個平板上分別挑取10個可疑菌落和10個典型菌落進行證實實驗,如此需要40根GBLB肉湯管。建議使用鎳合金接種環(huán),以為VRBA上生長的菌落大部分在底層、且菌落一般比較大,被培養(yǎng)基覆蓋,傳統(tǒng)的接種環(huán)較細(xì),用以刮去上層培養(yǎng)基比較方便,挑取菌落也比較方便。

 

 

04
如何進行證實實驗,菌落選取數(shù)量?

 

 

建議新手們VRBA上的所有不同形態(tài)的菌落都進行證實實驗。每種不同形態(tài)都挑取5-10個進行證實實驗(BGLB管足夠,建議多挑選幾個進行實驗)。

 

注意:A. 每種可疑菌落挑取5個,每個菌落放入1根GBLB管中;B. “產(chǎn)氣者,記為大腸菌群陽性管‘’,就要求在實驗前必須認(rèn)真篩選BGLB管,凡產(chǎn)氣的GBLB管應(yīng)棄去不用。

 

05
 
結(jié)果如何計算?

 

首先,在VRBA培養(yǎng)24h后進行計數(shù),分別計數(shù)可疑大腸菌群和典型大腸菌群的數(shù)量。假如在1:10的平板上的可疑大腸菌群有10個,典型大腸菌群有6個;然后進行證實實驗,假如10個可疑大腸菌群中有3個證實為陽性,6個典型大腸菌群中有5個證實為陽性,則計算方法如下:最終大腸菌群數(shù)=經(jīng)證實的大腸菌群數(shù)=可疑大腸菌群經(jīng)證實的數(shù)量+典型大腸菌群經(jīng)證實的數(shù)量=10×(3/10)×10+6×(5/6)×10=80。

 

06
 
若平板上有很多菌落,最終證實全部為陰性,結(jié)果如何計算?

 

選取適宜菌落數(shù)的平板挑取菌落進行證實試驗,若證實全部為陰性,則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落,建議可疑和典型菌落分別挑取10個進行驗證試驗,若第二次證實實驗均呈陰性,以<1乘以最低稀釋度進行計算。

 

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